義歯洗浄剤は毎日使わないと真菌は落とせないかも
歯を毎日磨かないでもいい、と指導しないのに、毎日義歯洗浄しなくていい、とは指導するのは矛盾があります。同じ口の中に入ってるのに、なぜ清掃頻度が異なるのが許容されるのかわかりません。
そのためかどうかはわかりませんが、義歯洗浄剤は毎日やったほうがいいかどうか、に関するエビデンスはあまり豊富とはいえません。今回はその判断基準として使えそうな論文を読んでいこうと思います。
A comparative in vitro study of two denture cleaning techniques as an effective strategy for inhibiting Candida albicans biofilms on denture surfaces and reducing inflammation
Gordon Ramage , Adriana Zalewska, Donald A Cameron, Leighann Sherry, Colin Murray, Mary Beth Finnegan, Zvi G Loewy, Daryll C Jagger
J Prosthodont. 2012 Oct;21(7):516-22. doi: 10.1111/j.1532-849X.2012.00865.x. Epub 2012 Jun 1.
PMID: 22672417
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22672417/
Abstract
Purpose: Candida albicans is the predominant oral yeast associated with denture-induced stomatitis, and with an increasing population of denture wearers its incidence is increasing. Maintaining good oral and denture hygiene, through chemical and/or mechanical intervention, is essential to reducing this disease. The aim of this study, using a robust adherent C. albicans cell model system, was to evaluate and compare the efficacy of a novel denture cleanser to the efficacy of a commonly used dentifrice coupled with brushing.
Materials and methods: Four C. albicans strains isolated from individuals diagnosed as having denture-induced stomatitis, were adhered to denture acrylic resin sections (1 cm(2) by 1 mm thickness) and after 4 hours of growth, challenged daily sequentially for 4 days with a denture cleanser (Polident) or intermittently with denture cleanser (day 1), then dentifrice (Colgate Cavity Protection Toothpaste) and brushing (days 2 and 3) and denture cleanser (day 4). Colony forming units were evaluated for each treatment, as were the levels of regrowth. Scanning electron microscopy (SEM) was also performed. Microbial susceptibility testing and time-kill studies were performed on biofilms. A coculture model was also used to assess interleukin-8 (IL-8) production from treated biofilms.
Results: It was shown that sequential treatment with the denture cleanser killed and inhibited regrowth each day. Intermittent treatment showed that viable C. albicans biofilms were only retained rather than being dispersed, which could be visualized by SEM. Time-kill studies demonstrated that the novel denture cleanser was highly active and killed quickly, unlike the dentifrice. IL-8 was expressed in greater levels in 24-hour biofilms than in 4-hour biofilms, but treatment with denture cleanser reduced IL-8 output.
Conclusions: The data indicate that maintaining good oral health for denture wearers requires daily use of a denture cleanser rather than an alternating regimen. The inability of the denture cleanser to sterilize during intermittent treatments demonstrates the difficulty in controlling established biofilm. Moreover, the presence of mature biofilm may result in high levels of inflammation, but this can be controlled through denture cleansing.
目的：C. albicansは義歯性口内炎に関連する主な酵母真菌で、義歯装着者の増加により義歯性口内炎も増加しています。化学的、機械的清掃により、口腔と義歯のよい衛生を維持する事が、義歯性口内炎を減少させるのに重要です。本研究の目的は、頑健な付着性C. albicans細胞モデル系を用いて、新規義歯洗浄剤の有効性を、一般的に使用されている歯磨剤とブラッシングの併用による有効性と比較評価することです。
実験方法：義歯性口内炎と診断した患者から採取した4種類のC. albicans株を、床用アクリルレジン(1cm2、1mm厚）に付着させ、4時間発育しました。その後、4日間毎日義歯洗浄剤(ポリデント）を使用群、1日目は義歯洗浄剤を使用し、2、3日目は歯磨剤を用いたブラッシング、4日目は義歯洗浄剤を使用群に分けました。再発育のレベルとしての、コロニー形成を評価しました。SEMによる評価も行いました。バイオフィルムの微生物感受性試験とタイムキル試験を行いました。共生培養モデルを使用してIL-8生成を評価しました。
結果：毎日洗浄群では、、C. albicansは毎日死滅、再発育を抑制されました。間欠的に洗浄剤を使用した群では、生存しているC. albicansのバイオフィルムは分散されるのではなく、保持されるだけであることが示され、SEMで可視化することができました。タイムキル試験では、義歯洗浄剤は歯磨剤と異なり、高い活性を有し、迅速に死滅させることがわかりました。24時間発育のバイオフィルムにおけるIL-8のレベルは、4時間発育のバイオフィルムよりも高くなりましたが、義歯洗浄剤使用により低下しました。
結論：義歯装着者がよい口腔内の状態を保つためには、毎日義歯洗浄剤を使用することが必要であることが今回のデータから示唆されました。間欠的な義歯洗浄剤の使用は、義歯洗浄剤の能力を十分に発揮することが出来ず、確立されたバイオフィルムを制御することの難しさを示しています。さらに、成熟したバイオフィルムにより、炎症レベルが高くなる可能性があります。しかし、その炎症レベルは義歯洗浄剤でコントロール可能です。
ここからはいつもの通り本文を適当に抽出して意訳要約します。誤訳もあり得ますので、気になったら実際の本文をご確認ください
緒言
口腔咽頭のカンジダ症（OPC)は最もCandida属、C. albicansが最も多い、による日和見感染が原因です。口腔粘膜、舌、口蓋の広い範囲に偽膜性の白色病変が特異的に発生します。OPCが死亡に関連する事はほぼあまりませんが、しばしば重大な罹患率を経験し、個人と医療システムの両方に大きな負担を強いることがあります。OPCの徴候は、味の変化や疼痛(しばしば灼熱感と呼ばれる）などが含まれます。このような全般的な症状の結果、この疾患はしばしば過小診断され、適切な治療が行われません。しかし、抗真菌薬処方後でさえ、しばしばコロニー化が再構築されています。その後、問題は、免疫抑制の根本的な原因が特定されなかったり、治療できなかったりすると、定期的に問題が生じます。
OPCの最も一般的なタイプの1つは紅斑型で、義歯のような補綴物の装着と関連し、義歯性口内炎、口腔粘膜の炎症を引き起こしますう。C. albicansは抗真菌剤に耐性のある口腔軟組織および硬組織に容易に付着し、弾力性のあるバイオフィルムを形成する能力により、義歯性口内炎の主な原因菌として関与しています。C. albicansは、他の歯科材料よりも、PMMAレジンに優先的に付着してバイオフィルムを形成し、義歯性口内炎に関与する事が示唆されています。
アクリルレジン上でのバイオフィルムの増殖は、化学的、機械的手段による微生物の効果的な除去にとって大きな課題となります。数多くの機械的、化学的義歯清掃器具が一般に入手可能であり、効果は様々です。義歯装着者がどれを選ぶか迷うのは想像に難くありません。最近のシステマティックレビューでは、異なる義歯清掃方法の有効性の比較に関するエビデンスが不足していることが示唆されています。6つのRCTの解析から、化学的義歯洗浄と機械的義歯清掃の比較試験に関する情報が不足していることが推測されました。この点については、並行して行われた分析でも同様のことが述べられており、化学的洗浄、機械的清掃、または両者の併用のどれが最適な義歯清掃方法なのかが不明瞭であると、結論づけられています。しかし、様々な義歯洗浄剤で義歯をブラッシングした場合、義歯に付着する微生物量に大きなばらつきが見られたことから、微生物バイオフィルムを効率的に除去するためには、義歯を定期的に消毒することが重要であることが認められました。本研究の目的は、義歯清掃材料よりむしろ義歯清掃方法を評価する事です。4日間連続で義歯洗浄剤に浸漬する方法と、1日目は義歯洗浄剤に浸漬、2、3日目は歯磨剤をつけてブラッシング、4日目は義歯洗浄剤に浸漬する方法の2種類の義歯清掃方法の有効性を比較しました。
実験方法
培養条件と株の特徴
以前の研究で用いた、義歯性口内炎患者から分離した4種類のC. albicans株を本研究で使用しました。これらの株は、義歯性口内炎のニュートン分類で異なるレベルから分離しました。ニュートン分類0のGDS25、ニュートン分類1のGDS18、分類2のGDS3、分類3のGDS71の4種類となります。C. albicans株はSAB培地上で37度夜間培養されました。各株のコロニーを10mlの酵母ペプトンデキストロースに接種し、30℃のシェーカーで一晩留置しました。細胞は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水中で遠心分離され洗浄されました。酵母菌はNeubauer hemocytometerでカウントされました。RPMI1640培地中で1×106 cells/mlに調整しました。すべての操作は層流キャビネット内で行いました。
アクリルレジンの準備
定量解析、顕微鏡解析のために、1cm2のPMMAレジン試料を使用しました。試料は、業者指示に従い準備しました。本研究で使用された全ての試料は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水中で超音波洗浄した後に、紫外線15分照射にて予め消毒されています。
義歯洗浄
一般的に入手可能な義歯洗浄剤(ポリデント）と歯磨剤((Colgate Cavity Protection Toothpaste)を使用しました。以前に記載した通り、各C. albicansは、24well組織培養プレート内に置かれた1cm2のレジン試料上に、RPMI中1.0×106cells/mlの最適濃度で37度4時間培養されました。1.0×106cells/mlを1cm2のアクリルレジン試料上に塗布し、4時間培養し、初期バイオフィルムを形成させました。滅菌した真菌非塗布レジン試料をネガティブコントロール、真菌非塗布レジン試料をポジティブコントロールとしました。義歯の清掃方法はは以下の2種類です。A：4？、24、48、72時間目に義歯洗浄剤に、業者指定通り3分間浸漬。B：4時間目に義歯洗浄剤3分浸漬後、24、48時間目に歯磨剤を併用した機械的なブラッシング、72時間目に義歯洗浄剤3分浸漬。軟らかい毛の歯ブラシを用いて、二重蒸留水中の歯磨剤（25℃）の10% w/vスラリーで約2秒間ブラッシングした。2秒間という時間は、上顎義歯を磨くのに平均2分かかる事から面積比で算出しました。
生存細胞のカウントは以下のように行いました。義歯洗浄後に、試料を1mlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水が入ったbijou tubesに移し、5分間超音波洗浄を行いました。その後、Miles and Misraプレートカウント法を用いて、SAB培地上で総生存数を定量しなました。並行して、各時点で処理したアクリル樹脂標本をRPMIに再接種し、再生レベルを定量しました。洗浄されていないバイオフィルムに関しても定量しました。
電子顕微鏡によるスキャン
アクリルレジン試料をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、2%パラホルムアルデヒド、2%グルタルアルデヒド、および 0.15 M カコジル酸ナトリウム（pH 7.4）中の 0.15% w/v アルシアンブルーで固定しました。固定・乾燥した義歯床試料を金でスパッタコーティングし，日本電子製 JSM-6400 走査型電子顕微鏡で観察しました。
抗真菌感受性テスト
浮遊菌最小発育阻止濃度（PMIC）を測定するための抗真菌試験は、Clinical Laboratories Standards Institute（CLSI）のM-27Aブロスマイクロダイリューション法を用いて実施し、無柄菌最小発育阻止濃度（SMIC）は以前報告した方法で実施しました。これらの研究には、3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)で緩衝化したRPMIが用いられた。PMICについては、マイクロタイタートレイを37℃で培養し、48時間後に終点を目視で読み取りました。SMICについては、バイオフィルムを一晩増殖させた後、37◦Cで24時間処理しました。SMICは、抗C.albicansバイオフィルム活性を定量化するための先行研究から採用されたXTT（2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2Htetrazolium5-caboxanilide）還元アッセイを用いて、80％阻害で決定しました。
タイムキル
さらなる抗微生物活性の調査のために、各株のバイオフィルムを96ウェル培地に準備しました。10% w/vスラリーの歯磨剤25度で機械的洗浄または、義歯洗浄剤を40度で0.5、1、3、5、10分浸漬しました。XTTアッセイを用いてバイオフィルムの代謝活性を定量化しました。ポジティブ、ネガティブコントロールも同様に行いました。活性は、XTTのバックグラウンドレベルを差し引き、未処理のコントロールと比較した代謝活性の比例的減少を計算することで評価しました。
バイオフィルム宿主細胞の炎症
バイオフィルム上皮細胞共生培養モデルが、レジン清掃に対する宿主細胞の反応を評価するために開発されました。Rheinwald laboratoryから供給されたOKF6-TERT2上皮細胞は、keratinocyte serumfree medium中で37度、5％CO2中で、接着単層細胞として増殖させました。これらの細胞は、テロメラーゼの強制発現により不死化したケラチノサイト細胞株であり、サイトカイン誘導研究において初代口腔ケラチノサイトに類似していることが示されています。サイトカイン応答を評価するために、細胞を24ウェル培地のKSFM中に1×105細胞の密度で播種し、90％～100％になるまで増殖させましたた。バイオフィルム+－義歯洗浄剤処理に対するOKF6-TERT2細胞の炎症反応を評価するため、ELISA法を用いてIL-8タンパク質の放出を定量しました。バイオフィルムをアクリルレジン上で4時間または24時間増殖させ、義歯洗浄剤で処理した後、上述のように洗浄しましたた。処理したバイオフィルムと未処理のバイオフィルムを含むアクリル樹脂試験片を吊り下げ式インサートに取り付け、バイオフィルムを反転させた状態で上皮細胞を含むウェルに入れました。このモデルでは、バイオフィルムと細胞との間に0.5mmの隙間を設けることができ、上皮細胞の直接的な培地飢餓を避けることができました。Toll様受容体2（TLR2）を活性化するS. cerevisiae由来のグルカン細胞壁成分であるZymosan A（ZYM）をIL-8誘導の陽性対照として用いました。OKF6/TERT2細胞を37度、5% CO2中で24時間刺激した。その後、細胞上清を除去し、IL-8 ELISAをメーカーの指示に従い実施しました。結果は、450nmにおける色彩変化を定量化する4パラメータカーブフィットを用いて計算しました。
統計処理
両側t検定を行い、有意水準は全て5%としました。
結果
義歯清掃がバイオフィルム発育に与える効果を図1に示します。4時間培養の未成熟なバイオフィルムは義歯洗浄剤で完全に抑制されているのがわかります。処理後24時間、48時間、72時間のいずれのアクリルレジン試料でも増殖が認められませんでした。再増殖は4日間義歯洗浄群(A群)では認められませんでした(図1A)。B群においても4時間培養のC. albicansバイオフィルムは義歯洗浄剤で完全に抑制されました。しかし、その後の歯磨剤でのブラッシングでは、バイオフィルムの残留が認められました。24時間目の残留レベルは0.5%でしたが、48時間目には50%となりまｓちあ。バイオフィルムの再増殖は24時間目で8%、48時間目で343%となりました。最後の義歯洗浄剤による洗浄で生存バイオフィルムは90%減少しましたが、残存細胞からの再発育が観察され、その結果、4時間未処理のバイオフィルムの434％に達しました。
24時間目に義歯清掃を行ったレジン表面のSEM画像では、義歯清掃の種類に関係なく、酵母と菌糸が残存しており、特に、材料表面のクラックと欠陥部位に認められました。しかし、義歯清掃を行っていない試料より、目視できる細胞数は少数でした。
バイオフィルム代謝の抑制効果について表1に示します。PMICとDMICをそれぞれの株で調べましたが、義歯洗浄剤(PMIC 6.25%は、歯磨剤(PMIC 25%)よりも浮遊細胞に対する高い抑制効果を示しました。バイオフィルムに対しても、義歯洗浄剤(SMIC 25%)は、歯磨剤(SMIC 50%)よりも高い抑制効果を示しました。
タイムキル試験では、スラリー状の歯磨剤は、最も殺真菌性が低く、10分間の暴露後に代謝は53％に減少しただけでした。義歯洗浄剤は高い活性を示し、30秒間で96.5%代謝を抑制し、10分後も97%と抑制効果が維持されました(図3)。
義歯洗浄剤を用いて制御可能なバイオフィルムにより惹起される炎症反応(図４)について、口腔上皮細胞と同時培養したバイオフィルム（4時間および24時間）は、4時間目の未熟なバイオフィルム（約600 pg/ml [p < 0.001]）よりも24時間目のバイオフィルムの方が有意に高いレベルのIL-8（約1500 pg/ml）を誘導しました。バイオフィルムの清掃により、口腔上皮細胞からのIL-8の誘導レベルは、24時間については有意に減少したものの、未成熟な4時間目のバイオフィルムでは有意差はありませんでした。
考察
義歯表面に微生物が存在すれば過剰なバイオフィルムが発育し、口腔疾患に罹患する可能性があるので、義歯の除染は効果的な口腔衛生のための鍵です。C. albicansは、義歯性口内炎を含む口腔カンジダ症から分離される主な酵母真菌であり、様々な表面にバイオフィルムを形成する能力があります。臨床的にこの病気と診断された人に加え、感染した義歯を装着している多くの人は無症状です。臨床的な管理が全てのケースに可能なら必要です。口腔内でC. albicansが抑制されずに増殖する可能性、すなわち口腔悪性腫瘍との関連が示唆されている状況を考えると、これは特に重要です。そのため、日常的な口腔衛生に加えて、義歯の除染は、義歯上にバイオフィルムとして存在するCandida属を減少、除去するのに極めて重要です。義歯洗浄剤は、in vitroの研究ではC. albicansを殺菌、破壊した一方で、完全に除染できるわけではないということが報告されています。
本研究では、2つの一般的な義歯の清掃方法がCandidaバイオフィルムのコントロールに有効かを比較しました。in vitroのモデルでは、毎日義歯洗浄剤を使用した群の方が、義歯洗浄剤の合間に歯磨剤によるブラッシングを行った群と比較して、有意にC. albicansの付着量が減少することが示されました。対照的に、義歯洗浄剤と機械的な清掃の併用は、義歯洗浄剤単独よりもC. albicansの消毒に有効であることが報告されています。しかし、これらの解析は粗いアクリルレジンではなく、ステンレス鋼上で行われており、スムースな表面により機械的除去の効果を促進した可能性があります。コロニー化したアクリルレジン試料に毎日義歯洗浄剤を使用すれば、C. albicansをほぼ0に維持できる事が示された一方で、義歯洗浄剤と機械的清掃を断続的に行うのは全く効果的ではありませんでした。義歯洗浄剤は歯磨剤より遙かに効果的でした。義歯洗浄剤の方が効果が高いのは、酸化能が殺真菌性を高めており、C. albicansの再増殖とバイオフィルム形成を抑制しているからかもしれません。これは、歯磨剤と比較して洗浄剤が迅速かつ効果的にC. albicansバイオフィルムを殺菌していった、MICとタイムキル試験で確認されました。歯磨剤の限られた殺菌効果は、機械的なブラッシングによって増強されるはずですが、2日目、3日目に再増殖したことから、そうではないことが確認されました。
以前の研究では、浸漬するタイプの化学的な義歯洗浄剤では完全にCandidaを消滅させることは難しい事が示唆されています。SEM画像で、レジンの溝やクラックにCandidaが存在するのを確認しました。そのため、化学的洗浄の後でも小数は生き残っており、それが栄養のある環境に置き換わると、バイオフィルムの再増殖を可能にするでしょう。これらの細胞は、C. albicansを長期間保菌している人に存在することが示されているパーシスター細胞の表現型を示す可能性があります。加えて、最近のデータから放出された細胞外グリカンが抗真菌物質を隔離し、感受性を低下させることが分かっており、細胞外高分子物質が化学洗浄のダメージから細胞を保護しているかもしれません。薬剤排出ポンプも、C. albicansの増殖中に発現が異なることが示されています。そのため、これらは義歯洗浄剤に抵抗するバイオフィルムの能力を増強する可能性があります。
これらの要因は、無傷なバイオフィルムの研究において、化学的洗浄のみ使用が効果的はなかった事を説明するかもしれません。本研究の結果は、他の口腔微生物叢の増殖やコロニー形成をサポートし、義歯性口内炎などの口腔疾患につながる可能性のあるカンジダ菌の過剰な増殖を防止することにより、義歯上のC. albicansを毎日の化学的アプローチで制御できる真の可能性があることを示唆しています。また、義歯洗浄剤を頻繁に使用することで、炎症性ケモカインIL-8の放出が抑制されることも示されました。
これらのデータの注意点は、実験の実施方法、つまりin vitroでのモデリングという文脈で解釈すべきであるということです。この研究は、義歯の平均的な使用期間と比較して比較的短い期間で実施されたため、管理された条件下でこれらのサンプリング方法を生体内で調査することで、定期的な化学的義歯洗浄を支持する、より確実なデータが得られるでしょう。義歯床材の劣化を防ぐために、浸漬タイプの義歯洗浄剤の毎日の使用は、特に水の温度に注意して、製造者の指示に従って使用することが重要です。
結論
in vitroのモデルでは、毎日義歯洗浄剤を使用することは、断続的に義歯洗浄剤と歯磨剤によるブラッシングを行うよりも有意に義歯上のC. albicans量を減少させる事が示されました。
まとめ
あくまでin vitroでの実験系のため、これを人に完全に置き換えることは難しいかもしれません。しかし、4日間の実験で毎日義歯洗浄剤を使用した群と、1，4日目だけ義歯洗浄剤を使用して2、3日目は機械的な清掃を行った群では、明らかにカンジダのバイオフィルム量に差があります。図1は縦軸が指数関数になっているので見方に注意が必要です。
しかし、毎日洗浄群では必ず24時間で一定量が増殖してきていますが、断続的に行っている群では、48時間機械的清掃後→72時間洗浄前で細菌数が減少しており、しかも毎日洗浄群の72時間目よりも細菌数が少ない気がするんですが、これはどう解釈すればいいんでしょうか・・・・。バイオフィルムが成熟してくるとまた挙動が違うんですかね。
どちらにしても、定着したバイオフィルムが成熟すると、その後は洗浄剤を使ってもなかなか落ちそうにありません。歯科医院で強力な洗浄剤でお湯＋超音波洗浄して一度かなり綺麗にリセットすると良いのかもしれません。そういう意味で歯科医院での義歯の洗浄、特に汚れやすい人の洗浄は意味があるのかもしれません。そして、洗浄は当然毎日行う様に指示、というのがこの論文から示唆される内容かもしれません。あくまでin vitroですけどね。
